Uma nova ferramenta de edição de DNA com grande potencial para revolucionar o futuro da genética -CRISPR

CRISPR

A CRISPR é uma nova ferramenta de edição de genoma que pode transformar esse campo da biologia.

O sistema CRISPR (do inglês Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), ou seja, Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas, consiste em pequenas porções do DNA bacteriano compostas por repetições de nucleotídeos. Cada uma dessas repetições encontra-se adjacente a um “protoespaçador” (“espaçador de DNA”), que corresponde a uma região não-codificante inserida no DNA bacteriano após o contato com genomas invasores provenientes de bacteriófagos ou plasmídeos. A transcrição do locusCRISPR resulta em pequenos fragmentos de RNA com capacidade de desempenhar o reconhecimento de um DNA exógeno específico e atuar como um guia de modo a orientar a nuclease Cas, que irá promover a clivagem e consequente eliminação do DNA invasor caso este entre novamente em contato com a bactéria, atuando como importante mecanismo de defesa contra DNAs invasores.

Permite aos pesquisadores alterar facilmente as sequencias de DNA e modificar a função genética. Suas muitas aplicações potenciais incluem a correção de defeitos genéticos, o tratamento e a prevenção da propagação de doenças e a melhoria das culturas. No entanto, sua promessa também suscita preocupações éticas.

CRISPRs são trechos especializados de DNA. A proteína Cas9 (ou “CRISPR-associado”) é uma enzima que age como um par de tesouras moleculares, capaz de cortar fios de DNA.

ORIGEM DO CRISPR

Originalmente encontradas no genoma de Escherichia coli em 1987 e descritas por Yoshizumi Ishino e colaboradores, as sequências curtas intercaladas regularmente só começaram realmente a ser investigadas no início dos anos 2000, sendo então encontradas em diversos outros organismos procarióticos, tanto do domínio Bactéria, quanto Archaea  e em 2002 a sigla CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) foi criada para denominar tais sequências. Francisco Mojica descobriu CRISPR de forma independente em 1993 e em 2003, ele descobriu que o DNA repetitivo nas bactérias geralmente ficava ao lado de pedaços de DNA que combinavam com vírus que atacavam esse tipo de bactéria.

Somente em 2005 foram obtidas as informações necessárias para indicar a função destes locus. Foi descrito que as sequências espaçadoras têm origem extracromossômica, sendo derivadas de sequências de plasmídeos ou de vírus. Além disso, foi também descrito que vírus tornam incapazes de infectar arqueias que possuem sequências espaçadoras correspondentes ao seu genoma, inseridas após uma infecção prévia. 

No ano seguinte foi postulada a hipótese de que o CRISPR é um sistema de defesa adaptativo de bactérias e arqueias que faz uso de RNA antisenso como assinaturas de memória de invasões anteriores . Esta proposta recebeu o suporte necessário quando foi evidenciada experimentalmente em Streptococcus thermophilus, levando a sua primeira aplicação no campo da biotecnologia, a fim de imunizar bactérias utilizadas na indústria de laticínios contra infecção por bacteriófagos. 

Evidências obtidas em seguida mostraram que as sequências espaçadoras de DNA invasor intercaladas com os arranjos de repetições intrínsecas são transcritos em grandes moléculas de RNAs, e estas são cortadas em pedaços menores pela nuclease Cas9 auxiliada pelo tracrRNA, tornando-se crRNAs, que por sua vez formam complexos com as proteínas tipo Cas. O complexo age de forma a impedir a proliferação viral em bactérias, devido a capacidade de clivagem do DNA invasor pela Cas9, o complexo tracrRNA-crRNA tem um papel fundamental no direcionamento desta nuclease, tendo o DNA invasor como alvo.

Nos últimos anos, estudos mostraram que aparentemente a Cas9 é a principal nuclease envolvida no processo de clivagem de DNA invasor  dentre os vários tipos de Cas descritos,  algumas ainda precisam ter suas funções elucidadas.

Em 2011, foi demonstrado que é possível transferir a memória imune de uma espécie de bactéria para outra, gerando novas possibilidades de aplicações do mecanismo , o que levou aos estudos que mostraram que Cas9 purificadas são capazes de clivar DNA alvo in vitro quando guiadas por crRNAs . O que resultou na utilização do sistema CRISPR como uma ferramenta de engenharia genética, tornando possível editar com sucesso o genoma de células de mamíferos, assim como de inúmeros outros sistemas modelos.

MECANISMOS DE ATUAÇÃO DO CRISPR

* Aquisição de novos protoespaçadores: Geralmente realizada através do reconhecimento e clivagem de ácidos nucleicos exógenos mediados por Cas1 e Cas2 para sua integração ao cromossomo bacteriano em regiões conhecidas como locus CRISPR.

* Transcrição completa do locus CRISPR como um pré-crRNA: Processamento e amadurecimento do transcrito em pequenas moléculas de RNA (crRNA) capazes de reconhecer uma única sequencia alvo.

*Associação com proteínas Cas: Formação de complexo ribonuclear capaz de guiar nucleases de maneira especifica em direção ao DNA alvo presente em bacteriófagos e plasmídeos.

BENEFÍCIOS DO SISTEMA

Inúmeras são as vantagens obtidas pelo emprego do sistema CRISPR uma vez que trata-se de uma metodologia rápida, fácil com baixo custo e principalmente com alta taxa de sucesso devido a sua alta sensibilidade para o reconhecimento de sequências específicas presentes no DNA alvo de células em cultura ou até mesmo em modelos animais.

Com o emprego desta metodologia é possível avançar mais rapidamente no ramo da engenharia genética e no estudo funcional gênico, o que pode ser justificado pela capacidade desta ferramenta em excluir ou modificar genes específicos para obtenção de organismos geneticamente modificados passíveis de serem empregados como modelo de estudo para compreensão de condições fisiopatológicas nas mais diversas espécies.

MAPEAMENTO GENÔMICO E FUNCIONAL

A identificação de genes responsáveis por um dado fenótipo de interesse é facilitada pelo sistema CRISPR/Cas9, devido a sua habilidade de alterar diferentes alvos, individualmente ou mesmo simultaneamente.CRISPRi e CRISPRa em estudos de escala genômica vem buscando genes endógenos que atuem como repressores ou ativadores transcricionais relacionados a supressão de tumores, regulação de diferenciação e a sensibilidade celular para cólera ou toxina da difteria, por exemplo, demonstrando suas aplicações como ferramentas fundamentais para complexos de mapeamento.

CRISPR NO TRATAMENTO DE DOENÇAS INFECCIOSAS

Conforme definição o complexo CRISPR/Cas age como um sistema imune adaptativo antiviral em bactérias, dessa forma, pode ser empregado para o tratamento de doenças infecciosas em indivíduos contaminados pela eliminação do genoma do agente infeccioso.

O uso desse sistema tem destaque especial na terapia de HIV através do bloqueio da proliferação do vírus. Demonstrou-se que perturbação da região LTR (repetições longas terminais) pode ser realizada em vírus HIV-1. O DNA do vírus contém duas regiões LTR e ambas as extremidades podem se integrar ao genoma, o que significa que o sistema CRISPR/Cas9 tem a capacidade de remover a sequência do HIV associado por clivagem em ambas as LTRs, retirando assim a sequência de HIV integrada ao DNA de indivíduos infectados. A técnica ainda se encontra em um estágio inicial, mas se mostra muito promissora na determinação de alvos através de um sistema de entrega segura e eficaz.

CORREÇÕES DE DESORDEM GENÉTICA

A tecnologia CRISPR-Cas9 também vem sendo amplamente estudada como ferramenta na cura de doenças genéticas. Usando camundongos como modelo, por exemplo, a falha genética causadora da catarata foi corrigida (reparo do fenótipo funcional da doença) pela injeção de CRISPR/Cas9 em zigotos. 

Cas9:  A proteína Cas9 é uma enzima que corta DNA estranho.

UTILIDADES E LIMITAÇÕES

Estudos utilizando modelos in vitro (laboratório) e animais de doenças humanas demonstraram que a tecnologia pode ser efetiva na correção de defeitos genéticos. Exemplos de tais doenças incluem  fibrose cística, catarata e anemia de Fanconi , de acordo com um artigo de revisão de 2016 publicado na revista Nature Biotechnology. Esses estudos abrem caminho para aplicações terapêuticas em seres humanos.

A tecnologia CRISPR também foi aplicada nas indústrias alimentar e agrícola para engenharia de culturas probióticas e para vacinar culturas industriais (para iogurte, por exemplo) contra vírus. Também está sendo usado em culturas para melhorar o rendimento, tolerância à seca e propriedades nutricionais. Uma outra aplicação potencial é criar unidades de genes. Estes são sistemas genéticos, que aumentam as chances de uma característica particular passando do pai para a prole. Eventualmente, ao longo das gerações, a característica se espalha por populações inteiras, de acordo com o  Instituto Wyss . 

Os movimentos de genes podem ajudar a controlar a propagação de doenças como a malária, aumentando a esterilidade entre o vetor da doença, mosquiteiros femininos  Anopheles gambiae , de acordo com o artigo 2016 Nature Biotechnology. Além disso, as unidades de genes também podem ser usadas  para erradicar espécies invasivas e reverter a resistência a pesticidas e herbicidas , de acordo com um artigo de Kenneth Oye, de 2014, publicado na revista Science. No entanto, CRISPR-Cas9 não está sem suas desvantagens. “Eu acho que a maior limitação do CRISPR é que não é 100% eficiente”, disse Church à Live Science. Além disso, as eficiências de edição do genoma podem variar. De acordo com o artigo de Cielo 2014 de Doudna e Charpentier, em um estudo realizado em arroz, a edição de genes ocorreu em quase 50% das células que receberam o complexo Cas9-RNA. Considerando que, outras análises mostraram que, dependendo do alvo, as eficiências de edição podem atingir 80% ou mais. Há também o fenômeno de “efeitos fora do alvo”, onde o DNA é cortado em locais que não o alvo pretendido. Isso pode levar à introdução de mutações não intencionais. Além disso, Church observou que mesmo quando o sistema corta o alvo, há uma chance de não conseguir uma edição precisa. Ele chamou esse “vandalismo do genoma”.

A CRISPR pode um dia ser a cura para diversas doenças genéticas, mas obviamente a manipulação genética é um assunto delicado do ponto de vista ético e algo muito distante de se tornar comum no nosso cotidiano. Mais próximas da realidade estão outras criaturas geneticamente modificadas, e não apenas as em laboratório. A CRISPR pode se tornar uma grande força na ecologia e conservação de espécies, especialmente quando usada em conjunto com outras ferramentas de biologia molecular. Ele poderia, por exemplo, ser usado para introduzir genes que podem lentamente matar os mosquitos que transmitem malária. Ou genes que limitem espécies invasivas como ervas daninha. Pode ser também o próximo grande passo na conservação ou melhoria do meio ambiente, abrindo assim uma caixa com novos riscos e recompensas.

Com as recentes notícias de edição de embriões humanos, A CRISPR ganhou bastante atenção e destaque como um tratamento médico do futuro. Mas focar na medicina apenas é pensar pequeno demais. Engenharia genética precisa tem o potencial de não apenas nos mudar, mas também mudar o mundo inteiro e todos os seus ecossistemas(QUANTA ,THE SCIENTIST,NOVA NEXT).

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